基于ERS-UPR信号通路研究青蒿素类药物调控溃疡性结肠炎的分子机制

Endoplasmic reticulum stress (ERS) is a protective response to maintain the normal function of intestinal cells, however, continuous and excessive ERS or dysfunction of unfold protein responses (UPR) would damage the intestinal homeostasis and induce ulcerative colitis (UC). Besides the famous significant antimalarial role, artemisinin and its derivatives (artemisinins) also possesses obvious regulatory effects on various inflammation, and inhibit or attenuate the occurrence of UC in mice, but, the effects of artemisinins on ERS-UPR pathway remains unclear. Both RNAi technology and ERS agonists will be used to treat the cell lines and animal UC model, while combined with artemisinins. After that, collecting the cell and intestinal tissue samples, and real time PCR, western-blot and laser confocal microscopy will be employed to detect the ERS marker molecules such as GRP78, GRP94 and caspase-12. In addition, the expression and location of the key proteins in PERK-eIF2α, IRE1-XBP1s and ATF6-ERSE induced by UPR will also be determined. Moreover, intestinal pathological alterations, nuclear factors-κB regulating genes, the influx of calcium ion into the plasm and cell autophagy will also be detected for illuminating the molecular mechanism of artemisinins modulating UC and offering the evidence for new indications of artemisinins.

内质网应激(ERS)是肠上皮细胞维持正常生理功能的一种保护反应，但持续过度的ERS及其诱导的未折叠蛋白反应(UPR)障碍则会破坏肠内稳态而诱发溃疡性结肠炎(UC)。青蒿素类药物除具有显著抗疟作用外，对各类炎症也有明显调控作用，并能抑制和减轻小鼠UC的发生，但其对ERS-UPR的作用尚不明确。本项目将在RNAi技术和ERS诱导剂处理培养细胞以及动物UC模型基础上使用青蒿素类药物进行干预。然后收集细胞和结肠组织样本，采用RT-PCR、Western-Blot及激光共聚焦等多种表征手段检测ERS标志物GRP78、GRP94、caspase-12和UPR信号通路PERK-eIF2α、IRE1-XBP1s和ATF6-ERSE中关键分子的表达与细胞定位，结合肠病变与NF-κB调控基因、内质网Ca失衡和细胞自噬等的测定，来阐明青蒿素类药物干预UC发病的分子基础，并为该类药物新适应症的挖掘提供依据。

内质网应激(ERS)是肠上皮细胞维持正常生理功能的保护反应，但持续过度的ERS及其诱导的未折叠蛋白反应(UPR)功能障碍则会破坏肠内稳态而诱发溃疡性结肠炎(UC)。青蒿素类药物除具有显著抗疟作用外，对各类炎症也有明显调控作用，并能明显减轻小鼠UC的发生，但其对ERS-UPR的作用尚不明确。本研究以DSS饮水制备小鼠UC模型，采用荧光定量PCR、免疫荧光/激光共聚焦、扫描电镜以及Western-blot等技术开展了结肠组织样品中ERS及其活化的三条下游信号通路（IRE1-XBP1s、PERK-elF2α、ATF6）中主要蛋白的活化表达，NF-κB蛋白磷酸化及其调控炎性因子、肠道病变和黏膜屏障以及凋亡关键蛋白表达情况的研究，从多个角度探索了ARS抑制UC的作用机制。研究结果表明：4%DSS口服5d可引起结肠段强烈的ERS，造成局部炎性损伤、细胞凋亡，黏膜屏障破坏，引发稀便和血便、体重下降甚至死亡等临床症状。腹腔注射15-30μg/kg 的ARS可显著抑制ERS标志蛋白GRP78的过度表达及下游感应信号通路中PERK-eIF2α-ATF4-CHOP和IRE1α-XBP1s两条信号通路的活化，对ATF6信号通路无明显作用，但仍能明显减轻NF-κBp65的活化及其调控炎性因子基因的表达，并减少肠上皮细胞凋亡，维护黏膜屏障而发挥保护效应。ERS诱导剂可削弱ARS的保护作用；相反，ERS抑制剂则可加强ARS的保护作用。在体外试验中，使用siRNA转染细胞将PERK和IRE1α基因knockdown后发现：PERK或IRE1α基因敲减可造成IEC-6细胞内的PERK和IRE1α蛋白的表达量极显著降低，并特异性地抑制了PERK-eIF2α-ATF4-CHOP和IRE1α-XBP1s两条信号通路中主要蛋白的表达；抑制PERK通路促进了ARS对细胞凋亡的抑制作用，抑制IRE1α-XBP1s通路则加强ARS对炎症的抑制作用。为了提高ARS对UC治疗的靶向性，先将ARS制备成纳米脂质体，再吸附壳聚糖/海藻酸钠而形成包合物，此包合物溶于水，故可口服给药，不仅提高了ARS的结肠靶向性，还实现了ARS在结肠局部的缓释，从而更好地发挥抗炎作用。上述结果较好地阐明了ARS通过抑制过度ERS及其下游两条感应信号通路的激活而减轻UC的作用机理，为ARS防治肠道疾病的拓展应用提供了重要参考。