肝癌候选抑癌基因PPEF2功能及临床作用的研究

Under the support of National Natural Science Foundation, we investigated loss of heterozygosity (LOH) of four hundred and forty SNPs located at 49 genes around D4S2964 in 112 hepatocellular carcinoma (HCC) tissues with a SNP microarray fabricated in house. High frequency of LOH at PPEF2 site was identified as high as 64.3%, and its mRNA was downregulated in 84% of HCCs and correlated with poor prognosis. Ectopic expression of PPEF2 could effectively inhibit tumor cell growth and colony formation, and arrest cell cycle at G1 stage. PPEF2 has not been reported of any biological functions to date and is a novel candidate tumor suppressor gene (TSG) for HCC. On this basis, this study will use sequencing, immunohistochemistry and western blot analyses of HCCs in order to elucidate its clinical significance; we will explore how transcription factors, miRNAs and epigenetic modifiers regulate the expression of PPEF2; stable cell lines over-expressing and downexpressing PPEF2 and Knockout mice will be established and be used to observe the influence of PPEF2 on HCC cell biological behaviors and tumor formation and metastasis in vitro and in vivo. The expression profiles of established stable cell lines will be determined by microarray or next-sequencing to figure out PPEF2 signal pathway with bioinformatics; the predicted signal pathway will be validated by molecullar biological experiments. This study will be identified a novel tumor suppressor genes of HCC, which help to elucidate the pathogenesis and provide a brand new biomarker for clinical diagnosis and treatment of HCC.

申请者自制SNP芯片对112例肝癌4号染色体D4S2964位点中49个基因进行LOH检测，发现PPEF2丢失率达64.3%，其mRNA在84%肝癌中低表达，且与病人的预后相关；上调该基因表达能抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成和细胞周期G1-S期阻滞。该基因在肿瘤中尚无报道，故提出这是一个全新的肝癌候选抑癌基因。在此基础上，本课题拟采用测序、免疫组化和蛋白印迹等分析肝癌样本中该基因的状态，以明确其在临床中的作用和意义；验证预测的调控该基因的转录因子和miRNA，检测表观修饰对该基因表达的影响，阐明调控该基因表达的机制；建立稳定上调、下调该基因表达的细胞株及基因敲除小鼠，在体内外观察PPEF2对肝癌发生发展的影响；检测其基因表达谱的变化，经生物信息学分析，找出受其调控的信号通路，并用实验证实。预期本课题将鉴定出一个全新的肝癌抑制基因，有助于阐明肝癌的发病机理并为临床诊治提供一个全新的标志物。

在前期研究发现的基础上，我们通过定量PCR的方法检测到了PPEF2基因在肝癌中DNA拷贝数丢失率达86.1%，证实了肝癌中PPEF2的高频率缺失;然而，外显子测序检测了肝癌组织DNA，未发现PPEF2突变；同时通过定量RT-PCR检测配对肝癌组织及癌旁组织112对的mRNA的表达水平，发现PPEF2在肝癌组织中低表达；采用免疫印迹方法检测肝癌组织及癌旁组织中PPEF2蛋白的表达情况，同样发现PPEF2在肝癌组织中低表达；免疫组化方法检测了多中心的750例肝癌样本，通过统计分析发现PPEF2在肝癌组织低表达，并与患者预后较差相关，同时PPEF2的表达水平是肝癌患者生存的独立影响因子。接着，在功能和机制方面，我们构建了多种过表达及敲低PPEF2的肝癌肝癌细胞系，对其进行了功能学的研究，发现PPEF2过表达可以抑制肝癌细胞的增殖，克隆形成，细胞周期的进程，使细胞周期阻滞在G1期，同时调控细胞周期蛋白，而敲低PPEF2呈现相反的现象。接下来我们通过全基因组表达谱芯片进行生物信息学分析，寻找PPEF2可能参与的生物学过程及信号通路的调控；通过质谱分析找到了与PPEF2作用的蛋白c-Myc并且通过免疫共沉淀等验证了其相互作用；通过免疫印迹、免疫荧光及q-PCR试验检测到PPEF2可以下调c-Myc蛋白但不影响c-Myc的转录水平。随后我们发现PPEF2可以通过蛋白酶体途径促进c-Myc的降解，同时根据文献报道，c-Myc是通过62位点丝氨酸脱磷酸基团，58位点苏氨酸磷酸化来进行蛋白降解的。我们通过一系列机制试验检测到PPEF2可以通过去磷酸化c-Myc丝氨酸62位点来下调c-Myc的蛋白水平。综上所述，我们证实了PPEF2是一个新发现的抑癌基因，并阐明了其作用机制，完成了本课题的研究计划和目标。目前研究成果已初步撰写成文，很快就能投稿，发表一篇高水平的SCI论文。此外，在研究课题经费的资助下，另外发表了3篇标注了本课题资助号的SCI论文。