候选抑癌基因CCDC158在肝癌中的作用及功能研究

在国自然基金资助下，申请者自制SNP芯片对112例肝癌4号染色体D4S2964位点中49个基因进行了杂合性丢失检测，发现CCDC158基因丢失高达45.5%,其mRNA在80%的肝癌中表达降低，且与病人的愈后相关；瞬转上调该基因的表达能抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成和诱导凋亡。经检索,未发现任何有关此基因的报道，故提出这是一个全新的肝癌候选抑癌基因。在此基础上，本课题拟采用测序、甲基化、免疫组化和蛋白印迹等分析150例肝癌中该基因的状态，以明确其在临床中的作用和意义；建立稳定上调和下调该基因表达的细胞株，在体内外观察其对肝癌细胞生物学行为的影响；检测其基因表达谱的变化，经生物信息学分析，找出受其调控的信号通路，并用实验予以证实；同时在体外及样本中验证预测的调控该基因的转录因子和miRNA。预期本课题将鉴定出一个全新的肝癌抑制基因，有助于阐明肝癌的发病机理并可能为临床诊治提供全新的方法。

我们的前期研究发现，位于4q21区带的微卫星标志D4S2964位点在肝癌中的杂合性缺失（LOH）频率高达50%(37/74)，推测此区域可能含有肝癌特异的抑癌基因；采用自制SNP芯片对该区域内所有基因进行LOH分析，发现CCDC158（coiled-coil domain containing 158）基因在肝癌中LOH率达45.5%（25/55)，进一步定量RT-PCR和Western blot方法检测发现肝癌组织中CCDC158 mRNA和蛋白表达与癌旁组织相比明显下调；定量PCR检测发现CCDC158 基因在肝癌中DNA拷贝数丢失率达54.5%（61/112)。在前期研究的基础上，我们采用常规测序方法检测了30对肝癌/癌旁组织DNA，没有发现有意义的突变；采用原位荧光杂交方法，发现6株肝癌细胞系中3株有CCDC158基因缺失，其频率为50%，与SNP杂合性分析和定量PCR方法检测的LOH频率非常接近；采用高分辨率熔解曲线法检测CCDC158基因启动子区域CpG岛甲基化状态，发现81.4%（35/43）的肝癌组织中甲基化率高于癌旁组织；在线生物信息学分析和双荧光报告基因实验均表明miR-3591-3p对CCDC158 3’UTR的结合和调控作用，且miR-3591-3p在肝癌组织中表达上调；免疫组化方法检测了多中心的370例（本院218例、外院152例）肝癌，发现46.8%的肝癌组织中CCDC158蛋白水平下降，统计分析发现其与肿瘤大小、TNM分期、肿瘤分级、有无癌栓、肝外转移及HBsAg阳性率有显著的相关性。Kaplan-Meier曲线显示，CCDC158 低表达患者的预后较差（P = 0.014）。以上研究揭示了肝癌组织中由于等位基因丢失、启动子甲基化和高表达miR-3591-3p调控等导致了CCDC158蛋白表达降低，并与肝癌的进展密切相关,确证了CCDC158是一个抑癌基因。在功能和机制方面，我们构建了多种CCDC158过表达和敲降的肝癌细胞系，对该基因进行了体内外功能学研究。结果发现，CCDC158基因过表达可抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力、EMT、裸鼠成瘤能力及肿瘤在裸鼠体内的转移能力。而CCDC158基因敲降在肝癌细胞中有相反的生物学功能。为研究CCDC158基因对肿瘤相关的重要分子和信号通路的影响，阐明其作用机制，我们采用全基因组表