淫羊藿苷对鱼藤酮致大鼠脑线粒体损伤的保护作用及分子机制研究

Parkinson's disease is a common neurodegenerative disease. The typical pathological features are substantia nigra dopamine neuron degeneration. Mitochondrial dysfunction and oxidative damage play a critical role in dopamine neuronal cell death. Stable expression and regulation of mitochondrial DNA genes are very important for maintaining the normal function of mitochondria and cells. Our recent study demonstrated that neurotoxins rotenone and manganese inhibit mitochondrial DNA replication and transcription. This project intends to adopt a rat model of rotenone-induced Parkinson's disease and utilize in vitro cell culture to further study the mitochondrial DNA replication and gene expression as well as the mechanism of oxidative mitochondrial DNA damage. Through purified mitochondria we will study mitochondrial permeability transition pore and mitochondrial DNA oxidative damage, and explore the reversibility of these changes. Moreover, we will investigate the protective effects of national medicine Icariin on mitochondrial function and oxidative DNA damage. By in vitro cell culture, we will genetically and pharmacologically manipulate expression of PGC-1α to further study the regulation mechanism of mitochondrial gene expression and oxidative damage, thus understand the role of PGC-1α signaling in neurotoxin rotenone-induced dopamine neuronal cell death.

帕金森氏病是一种常见的神经退行性疾病。其典型的病理特征是中脑黑质的多巴胺神经元细胞的退行变性。线粒体功能障碍和氧化损伤在诱导多巴胺神经元细胞的死亡中起着极为关键的作用。保持线粒体DNA的稳定和基因的表达调控对维持线粒体和细胞的的正常功能十分关键。我们最近的研究发现，神经毒素鱼藤酮和重金属锰抑制线粒体DNA的复制和转录。本项目拟采用鱼藤酮制备的帕金森病大鼠模型以及体外细胞培养对线粒体DNA的复制转录以及线粒体DNA氧化损伤的调节机制进行进一步研究。通过纯化线粒体，研究不同底物激活下线粒体通透性转换孔的功能以及线粒体DNA氧化损伤，并研究这些改变的持续和可逆性以及淫羊藿苷对线粒体功能和氧化损伤的保护作用。通过体外细胞培养，采用药理和遗传学手段操控PGC-1α的表达研究PGC-1α调控线粒体基因的表达和线粒体DNA氧化损伤的分子机制，寻找信号通路中的关键调控因子，为研究和开发民族药提供新思路。

本研究采用颈背部皮下慢性注射鱼藤酮（ROT， 1 mg/kg/day）制备帕金森病（PD）大鼠模型。首先通过免疫组化以及行为学研究发现，淫羊藿苷(ICA)显著减少ROT诱导的多巴胺（DA）神经元损伤，以及改善运动协调功能，确证ICA具有抗PD的作用。在此基础上，对线粒体功能进行评价。通过纯化的脑组织线粒体耗氧率的测定发现，ICA明显减轻ROT所导致的线粒体功能损伤，改善其功能。ICA对线粒体功能的保护从而抗PD的作用机制可能包括：1、抗氧化损伤。降低α-synuclein蛋白表达，提高SOD 活性减少ROS的产生，从而降低DNA和蛋白质的氧化损伤，保护DA 神经元；2、激活细胞自噬通路。ROT导致皮质和纹状体中Beclin-1和LC3-II蛋白表达水平下降，同时P62，p-mTOR，p-P70表达升高，表明自噬通路被抑制，而ICA给药明显激活LC3-II和Beclin-1蛋白表达，同时降低P62，p-mTOR，p-P70蛋白水平，改善ROT诱导的自噬通路的抑制。基于这些研究发现，采用PC12细胞株对ICA 抗PD的作用机制进一步研究。PC12细胞实验验证了ICA对ROT所致线粒体功能和细胞损伤具有保护作用。基因表达和蛋白水平分析发现，PGC-1α在线粒体功能和减低细胞内氧化应激水平发挥重要的调节作用。采用基因沉默技术以及不同的药物干涉发现，PGC-1α的表达水平受到SIRT3的调控。PD动物模型以及PC12细胞均发现ROT 导致SIRT3表达降低。而ICA能显著升高SIRT3表达，从而增加细胞内PGC-1α的表达，提高抗氧化酶SOD活性，降低细胞内ROS的产生。这些实验结果表明SIRT3-PGC-1α调控途径在ICA的神经保护作用中起着关键的作用。本研究为ICA抗帕金森病的后续研究提供了药理学基础。