基于AF4-UV-MALS-ICP/MS的纳米颗粒物与凝血相关因子相互作用及机理研究

Nanoparticals exposure is one of the most pressing public health issues, and is closely related to the occurrence of human cardiovascular disease. The imbalance of coagulation and anti-coagulation can lead to a variety of cardiovascular disease. Study on the interaction and molecular mechanism of nanoparticals and coagulation-related factors is the basis for an in-depth exploration of the coagulation mechanism. This study is to establish the detection system via asymmetric flow field -flow fractionation (AF4) coupled with ultraviolet-visible (UV) detector, multi - angle laser light scattering (MALS) detector and inductively coupled plasma mass spectrometer (ICP/MS), and study on the configuration and structure, thermodynamic characteristics (force, bonding, affinity), dynamics characteristics (adsorption percentage, dissociation rate) and understand the molecular mechanism of nanoparticles and coagulation-related factors interaction. Combined with animal experiment, study on the influence of nanoparticles on the organism coagulation function. The study will provide a theoretical basis for further research of cardiovascular disease caused by nanoparticles and providing key technical support for the application of AF4 separate system to study nanoparticles- biological molecules interaction.

纳米颗粒物暴露是当今最紧迫的公共卫生问题，与人类心血管疾病的发生发展密切相关。凝血与抗凝血平衡失调可以导致多种心血管疾病发生，研究纳米颗粒物与凝血相关因子相互作用的分子机理是深入探讨其凝血机制的基础。本课题利用新兴的非对称流场流分离技术（AF4）偶联紫外检测器（UV）、多角度激光散射仪（MALS）和电感耦合等离子体质谱仪（ICP/MS），建立样品处理简单、分离条件温和、分辨率高且分析范围宽的AF4-UV-MALS-ICP/MS分离检测体系，研究纳米颗粒物与凝血相关因子的结构形态变化，相互作用的热力学特征（作用力，键合点，亲和性）和结合动力学特征（吸附率，解离速率），明确纳米颗粒物与凝血相关因子作用的分子机理。结合动物实验，研究纳米颗粒物对机体凝血功能的影响。本研究将为纳米颗粒物致心血管疾病的深入研究提供理论基础，为应用AF4分离系统研究纳米颗粒物与生物大分子相互作用提供关键技术支撑。

日益广泛应用的纳米材料（至少有二维在1-100 nm的材料），导致人们通过环境暴露、职业暴露以及医源性暴露接触纳米材料的机会迅速增加。纳米材料可以入血液并蓄积在重要的组织器官，然而纳米材料在复杂生物体系中的理化性质如何？对生物大分子的构象与活性具有哪些影响？迄今为止未见系统报道。.本项目的主要研究工作包括：① 建立了AF4-DAD-MALS方法，成功地实现了生物体系中多粒径纳米材料与重要生物分子的分离分析，研究了不同粒径纳米二氧化硅（NPSiO2）与人血清白蛋白（HSA）之间的相互作用；② 使用等温滴定量热技术（ITC）、表面等离子共振技术（SPR），结合圆二色谱法（CD）、荧光光谱法（FL）和紫外可见光分光光度法（UV）研究了NPSiO2和碲化镉量子点（CdTe QDs）与HSA和凝血相关因子相互作用的结构形态变化，热力学特征（作用力，键合点，亲和性）和动力学特征（吸附率，解离速率），探讨了NPSiO2和QDs与凝血相关因子相互作用的分子机理； ③ 研究了NPSiO2和QDs对大鼠凝血功能的影响。重要研究成果包括：① 建立的AF4-DAD-MALS方法以NaCl做流动相，非常适合对生物样品中纳米材料的分离分析，以血液为基质，不同粒径NPSiO2的标准曲线线性良好（R2 > 0.99），检出限0.005-0.32μg，日内精密度RSD<3.5%，日间精密度RSD<13.7%，加标回收率为95.6-105%，该方法明显优于传统的离心分析方法；② HSA与不同粒径NPSiO2相互作用模式、亲和力、吸附力等差异较大，NPSiO2-20nm更易与HSA相互结合，且结合的数量多, NPSiO2可以引起HSA二级结构改变， NPSiO2-20nm所引起的改变具有剂量-效应关系，CdTe QDs与血浆蛋白相互作用，按亲和力大小，其顺序为：FIB > PLG > TM > MT-II > HSA，FIB和PLG的二级结构发生显著变化；③ NPSiO2和QDs染毒均会以内源性途径为中心对大鼠凝血功能产生影响，且该影响与NPSiO2和QDs的粒径大小、浓度和染毒后观察时间点密切相关。.本研究为纳米材料致心血管疾病的深入研究提供了更充实的理论基础，为应用AF4分离系统研究纳米颗粒物与生物大分子相互作用提供了关键技术支撑。具有实际意义。