细胞外囊泡异质性亚群快速分离方法的建立及在超细颗粒物致心血管损伤研究中的应用

As carriers of intercellular communication and signal transduction, extracellular vesicles （EVs）and its subpopulations exosomes (EXOs) and microvessels (MVs) provide a new idea for the study of cardiovascular damage (CVD) induced by particle matter (PM). In view of the difficulties in the extraction and purification of EVs and the separation of EXOs and MVs, we extract high purity EVs using the affinity reaction of TIM4 and phosphatidylserine. Then, we establish the detection system of EXOs and MVs with a mild separation conditions,high resolution and wide range analysis using a novel asymmetric flow field separation (AF4) coupled with multiple detectors (UV, MALS, DLS) and surface enhanced Raman scattering (SERS). The effects of ultrafine particles (PM0.1) on platelet-derived EXOs and MVs is investigated based on AF4 / UV-MALS-DLS-SERS. Through cell experiments and animal experiments, the damage effects of PM0.1-mediated EVs to cardiovascular system is identified. This study will provide the theoretical basis for the research of PM induced CVD, and provide the key technical support for the further study of the biological effects of EVs to promote the application in the pathogenesis, disease diagnosis and treatment.

细胞外囊泡（EVs）及异质性亚群外泌体（EXOs）和微囊泡（MVs）作为细胞间交流和信号转导的载体为颗粒物（PM）致心血管损伤(CVD)研究提供了新思路。本研究针对EVs提取、纯化及EXOs和MVs分离分析中的难点问题，拟利用TIM4与磷脂酰丝氨酸亲和反应，简便、快速、高效提取EVs；应用新兴的非对称流场流分离技术（AF4）偶联多检测器（UV、MALS、DLS），结合表面增强拉曼（SERS）技术，建立分离条件温和、分辨率高且分析范围宽的EXOs和MVs快速分离检测体系。基于AF4/UV-MALS-DLS-SERS研究超细颗粒物（PM0.1）对血小板来源的EXOs和MVs的影响；通过细胞实验和动物实验明确PM0.1介导EVs对心血管系统的损伤作用。本研究将为PM致CVD的研究提供理论基础，为应用AF4深入探讨EVs的生物学效应，促进EVs在致病机理、疾病诊断与治疗中的应用提供关键技术支撑。

研究表明，大气颗粒物（PM）已经对人类的心血管健康构成了严重威胁。其中细颗粒物（PM2.5），特别是超细颗粒物（PM0.1）不仅能进入肺泡，甚至能进入细胞核，具有更严重的生物效应。因此, 深入探讨PM2.5，特别是 PM0.1 对心血管系统的毒性作用对于保护人类心血管健康具有重要的意义。细胞外囊泡（EVs）作为细胞间交流和信号转导的载体为PM致心血管损伤(CVD)研究提供了新思路，然而PM如何通过EVs对心血管系统产生影响？迄今为止未见系统报道。.本项目选取血小板来源的细胞外囊泡（P-EVs）作为研究对象，主要研究工作包括：①建立了P-EVs及其异质性亚群的分离、纯化以及富集方法；②通过体外细胞实验研究了P-EVs介导的PM2.5对血管内皮细胞（HUVECs）的损伤机制；③通过体内实验研究了PM2.5暴露的P-EVs导致大鼠心血管组织的损伤作用及机制；④探究了PM0.1暴露的P-EVs异质性亚群特性及其对HUVECs存活率的影响。重要研究成果包括：①建立的AF4/UV-MALS-DLS分离检测体系可以对P-EVs及其异质性亚群进行温和、低损伤的分离、纯化与富集，以及颗粒数与粒径的准确表征；②PM染毒后的血小板分泌的EVs （PM-EVs）可穿过细胞膜，在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）内聚集，通过影响相关信号通路蛋白水平VEGF、Bcl-2、 Caspase-3及miRNA的表达，影响其增殖、凋亡功能，氧化应激能力，炎症反应水平，最终导致HUVECs损伤；③PM-EVs可以通过介导炎症反应和血栓形成引起大鼠主动脉和心脏损伤；④PM暴露不但可导致P-EVs及其异质性亚群数量与粒径改变，还可以影响其内容物中的重要生物分子，最终降低HUVECs的存活率；且不同亚群对HUVECs存活率的影响机制存在差异。.本研究将为PM致CVD的研究提供理论基础，为应用AF4深入探讨EVs的生物学效应，促进EVs在致病机理、疾病诊断与治疗中的应用提供关键技术支撑。