cystatin对心肌缺血再灌注损伤中M2型巨噬细胞的影响

Inflammatory change is a major cause of myocardial ischemia reperfusion injury(IRI). Recent studies found that measures based on inducing anti-inflammatory M2 macrophage could provide protective effects from IRI. However, some subtypes of M2 macrophage cause fibrosis, which may be harmful to the long-term outcome of organic repairment. Therefore, searching molecules which might selectively induce non-profibrotic M2 macrophage (M2b macrophage) is a key measure to ensure the application of the protective method. Cystatin from helminths has been demonstrated to induce M2b macrophage in vitro and in vivo. Therefore, in present study, we design the present study to testify the effect of another cystatin which was gained from Schistosoma japonicum (Sj-cystatin) on macrophage's polaration during myocadial IRI. We firstly obtain Sj-cystatin by genetic engineering methods. Using molecular biology and flow cytometry, we clarify the effects of cystatin om macrophage differentiation in vitro and then study the possible mechnisms of PPARγ in the process. Finally, recombinant Sj-cystatin will be used in two animal models to determine its effects on myocardial ischemia reperfusion injury. Results from this study can provide a novel way to find myocardial protective molecules and to establish a novel myocardial protection strategy, ultimately improve the effects of myocardial protection. Results can also give some clues for protecting other organ from ischemia reperfusion injury.

炎症反应是造成心肌缺血再灌注损伤（IRI）的重要原因。近年来，基于诱导具有抑炎作用的M2型巨噬细胞分化的策略开始在IRI中研究。但是由于此类细胞的部分亚型有促进组织纤维化的作用，非选择性诱导M2巨噬细胞不利于器官修复的远期效果。因此，寻找合适的诱导分子选择性诱导非促纤维化型M2巨噬细胞（M2b）分化是本技术应用的关键。寄生虫源性cystatin分子已被证实具有诱导M2b型巨噬细胞分化的作用。本研究在前期已对心肌IRI和日本血吸虫cystatin分子积累一定研究成果的基础上，利用基因工程的方法大量获取该分子。采用分子生物学和流式细胞分析技术明确cystatin对巨噬细胞分化的作用和PPARγ在cystatin分子活化M2型巨噬细胞的机制。并在不同动物模型中，验证其对心肌IRI的影响。本研究可以为寻找新型心肌保护分子提供思路，有助于建立新的心肌保护策略，提高心脏及其他器官IRI的保护效果。

心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）是体外循环心脏手术伴随的病理损伤，以早期过度炎症反应及晚期心肌重构为特点，严重影响患者手术效果及术后生活质量和寿命。固有免疫相关途径的过度活化是造成MI/RI的机制之一，随着免疫调节性炎症细胞的发现，越来越多的研究人员开始研究通过诱导此类细胞来治疗炎症过强性疾病，也有研究发现早期诱导抑炎性M2型巨噬细胞可减轻心肌损伤，但M2a和M2c亚型的活化可导致心肌纤维化，影响远期心脏功能。因此本课题设想，选择性诱导非促纤维化亚型（M2b亚型）巨噬细胞可在减轻IRI急性损伤的同时减少远期心肌纤维化，寻找合适的诱导分子也是本课题研究的关键。.本课题第一部分研究结果发现，寄生虫产生的半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatin）可诱导巨噬细胞向M2b亚型分化。首先，我们利用NCBI数据库的资源，经序列拼接获得日本血吸虫cystatin基因（命名为Sjcystatin），应用生物信息学软件推测其相关结构和功能，并应用原核表达体系，成功在体外表达Sjcystatin，获得此蛋白。然后通过酶底物抑制试验，确定其活性，并发现其酶活性具有剂量依赖性，在较广的pH值和温度范围内均保有活性。最后分析Sjcystatin对活化的巨噬细胞系RAW264.7的影响发现，其具有诱导M2b型巨噬细胞分化的作用，具体表现在对M1型巨噬细胞特征性的NO和促炎因子产生减少， IL-10产生增多，所有这些现象在重组蛋白刺激早期时相更为明显（6h、12h内）。.本课题第二部分，建立小鼠MI/RI模型，并将体外培养诱导的M2b型巨噬细胞局部注射至缺血心肌内，发现可明显减轻其缺血再灌注损伤，包括肌钙蛋白I、梗死面积、心肌凋亡指数等。对基因芯片发现的部分相关通路进行验证，其作用部分与A20可减轻NF-κB相关的凋亡有关。并初步发现Sjcystatin同样有缓解小鼠MI/RI的作用，但深入研究正在进行中。.本课题已圆满完成项目申请之初制定的目标，发现了心肌缺血再灌注损伤的新型治疗手段。发表SCI论文7篇，中文核心期刊1篇。Sjcystatin蛋白及M2b型巨噬细胞作为治疗新型药物正在申请国家专利。