miR-23a靶向APAF-1基因调控胰腺癌细胞凋亡的作用及分子机制研究

The biological functions and molecular mechanisms of miR-23a in tumors are unclear. Our previous study suggested that miR-23a is upregulated in pancreatic cancer and the bioinformation predicted that it may be involved in genesis and development of cancer through the signal transduction pathway mediated by APAF-1 . In this study, we intend to detect the expression of pri-miR-23a and mature miR-23a by using Real time-PCR in large samples of pancreatic cancer tissues. Meanwhile, we also plan to detect and analyze the molecular mechanisms of abnormal expression to explore the possibility of miR-23a as a molecular marker in tumorigenesis and progression．Through studying the function of miR-23a gene in AsPc-1 pancreatic cancer cell line and tumor-bearing nude mice,we further explore the impacts of the gene on biological behavior of pancreatic cancer in APAF-1 mediated apoptosis signal transduction pathway. These will provide the foundation for the future study on molecular markers in the gene diagnosis and therapy of pancreatic cancer.

miR-23a在肿瘤中生物学功能和分子发生机制尚不清楚。我们前期研究提示，miR-23a在胰腺癌中表达上调，且生物信息学预测提示可能通过APAF-1介导的信号转导通路参与肿瘤的发生和发展。在本项目研究中，我们拟扩大样本量应用逆转录-荧光定量PCR技术检测miR-23a初始miRNA和成熟miRNA在胰腺癌中的表达情况，并对其异常表达的分子机制进行检测与分析，探讨其作为胰腺癌发生和进展的诊断分子标志物的可能性；通过研究miR-23a基因在胰腺癌AsPc-1细胞系和荷瘤裸鼠中的作用，探讨该基因对胰腺癌生物学行为的影响及其在APAF-1介导的凋亡信号转导途径中的作用机制，为胰腺癌基因诊治分子标志物的深入研究奠定基础。

前期研究提示miR-23a可能作为癌基因通过下调APAF1表达参与胰腺癌发生发展。在本项目支持下：.I.我们扩大样本量应用逆转录-荧光定量PCR和原位杂交技术检测分析miR-23a基因在胰腺癌中的表达。研究发现①miR-23a在40例胰腺癌新鲜癌组织、95例石蜡包埋癌组织中表达水平显著高于各自癌旁胰腺组织；②各期胰腺癌miR-23a表达检测发现miR-23a表达与肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤分期和术后生存时间显著相关；③80例胰腺癌患者血清中miR-23a表达高于健康人群（P均<0.05）。提示miR-23a在胰腺癌中表达上调，发挥潜在癌基因功能，可能成为胰腺癌诊断、进展程度和预后判定的重要指标之一。.II.应用MTT、克隆形成和流式细胞术检测miR-23a基因对胰腺癌细胞生物学行为的影响。研究发现与对照组相比miR-23a mimics转染组胰腺癌细胞的增殖能力及克隆形成数目显著增加而早期凋亡率显著降低（P<0.01）。提示miR-23a促进胰腺癌恶性表型，发挥癌基因作用。.III．应用荧光素酶报告基因活性和western blot等技术检测miR-23a基因在其靶基因APAF1介导的凋亡信号转导通路中的调控效能。研究发现①miR-23a 和APAF1在胰腺癌组织和细胞中表达分别较癌旁组织和HEK293细胞显著增高和降低；②二者表达呈负相关（r=0.408）。③ Lut- APAF1-Wt和miR-23a mimics 共转染组荧光素酶报告基因活性相对于其它各组显著降低。④siAPAF1转染组胰腺癌细胞增殖能力及克隆形成数目显著升高而早期凋亡率显著降低（P均<0.05）。提示APAF1是miR-23a的靶基因； miR-23a部分通过APAF1调控胰腺癌细胞增殖与凋亡。.IV．应用lncRNA芯片、逆转录-荧光定量PCR等技术揭示miR-23a基因在胰腺癌中异常表达的ceRNA机制；研究发现①DNAJC27-AS1 在胰腺癌组织中表达下调，其表达与 miR-23a 表达显著负相关，而与 APAF1 mRNA 呈正相关。②Lut- DNAJC27-AS1-Wt和miR-23a mimics 共转染组荧光素酶报告基因活性相对于其它各组显著降低（P均<0.05）。提示miR-23a、DNAJC27-AS1与APAF1存在ceRNA调控机制。