基于代谢活性检测致病菌活菌的机理与应用基础研究

活菌检测技术能有效区分死菌和活菌，是致病菌快速检测的发展方向和新兴研究热点，近三年来，研究报导迅速增加。本项目针对现有活菌检测技术在原理和方法上存在的缺陷，以细胞代谢活性存在与否作为判断细菌存活的标准，设计合成不同类型的代谢活性敏感交联剂（ALC），它由三个功能基团构成：DNA结合基团，交联基团以及连接臂。ALC分子可以自由进出各类细胞并根据胞内的代谢活性有无产生"切断与否"两种反应。本研究以ALC和几种典型致病菌为研究对象，在细胞水平探明细菌在不同存活状态下代表性酯酶的代谢活性差异特征，在分子水平揭示细菌在死亡状态下DNA交联剂与DNA的作用规律，从而阐明基于代谢活性检测致病菌活菌的机理与关键技术环节。通过筛选优化ALC相关要素，建立新型的ALC-qPCR致病菌活菌分子检测技术。研究成果不仅提高检测效率和准确性，还是致病菌活菌检测原理和方法上的创新，对食品安全检测与控制具重要意义。

活菌检测技术能有效区分死菌和活菌，是致病菌快速检测的发展方向和新兴研究热点，近几年来，研究报导迅速增加。然而现有的检测技术均存在不足，开发快速、准确的活菌检测技术成为微生物检测领域的一大难题。区别于以往从是否可培养和细胞膜是否完整的角度来判断致病菌是否为活菌，本项目以细胞代谢活性存在与否作为区分活菌和死菌的标准。经过参考EMA/PMA分子中的叠氮基团对DNA扩增的抑制作用,结合噻唑橙自由穿透生物细胞膜的特性,设计并筛选了一种对细菌生物代谢活性敏感的新型噻唑橙荧光染料（thiazole orange monoazide,简称TOMA）， 明确了其合成路径。分子结构经高分辨质谱及核磁共振表征，分子量为474.6,吸收光谱在488 nm,发射光谱在520 nm。激光共聚焦显微镜显示TOMA分子对细胞膜具有自由穿透细菌壁膜的特性。HPLC显示，体外固定化脂肪酶能有效切割TOMA分子的酯键。荧光PCR结果显示，TOMA能有效抑制死菌DNA扩增，而活菌不受影响，TOMA的最佳使用浓度应为10 µg/mL。本项目以单增李斯特菌和沙门氏菌为研究对象，揭示了TOMA分子对菌株DNA的作用规律，筛选并优化TOMA相关要素，建立了最佳的致病菌活菌检测技术，阐明了基于细胞代谢活性用于检测食源性致病菌活菌的机理和关键技术环节。此外，对于来源复杂的食品中抑制因子可能潜在抑制扩增的情况，研制假病毒内标用于全程检测监控以防止假阴性。本项目是致病菌活菌检测原理上的创新，TOMA分子由概念到研究成功，有望推动活菌检测技术的发展。