不同时间窗电针干预抗心肌缺血再灌注损伤的自噬相关机制研究

Myocardial ischemia and reperfusion (I/R) can cause reperfusion injury (IRI) and how to reduce IRI is of great significance during myocardial recovery. Autophagy plays an important role in I/R process and the regulation of autophagy homeostasis by promoting moderate autophagy, avoiding excessive autophagy is the focus of modern research. AMPK-mTOR1-ULK1 and Akt-Bcl2-Beclin1 signaling pathway are important pathways for the regulation of autophagy in the process of myocardial I/R. The researches confirmed that acupuncture treatment in different stages of I/R have certain anti-IRI effect, but the difference of the effect and the mechanism is not clear. In this study, the rat model of myocardial ischemia was used to compare the different effects of electroacupuncture at different stages on IRI and explore the mechanism of autophagy from AMPK-mTOR1-ULK1 and AKt-Bcl2-Beclin1 signaling pathway, by serum enzyme, myocardial cell apoptosis and myocardial cell structure detection to evaluate the electroacupuncture effect ，electron microscopic to observe autophagy body and Immunohistochemistry, WB, qPCR to observe the expression of apoptosis gene Bax/Bcl2, mTOR1-ULK1-AMPK and Akt-Bcl2-Beclin1 signaling pathway. And in the meantime，to provide evidence for the time window of interventional treatment of acupuncture anti IRI.

自噬在心肌IR损伤中担当重要作用，通过促进适度自噬、避免过度自噬，调节自噬稳态来减轻IRI，是当前研究重点。AMPK-mTOR1-ULK1及Akt-Bcl2-Beclin1信号通路是心肌IR过程中调节自噬反应的重要途径。研究证实，不同时期的针灸介入，均存在一定程度的抗IRI作用，然而其效应差异及具体机制尚未明确。本研究以心肌IRI模型大鼠为载体，在通过血清酶谱、心肌细胞凋亡、心肌细胞结构检测等方法评价效应的基础上，以电镜观察自噬小体，免疫组化、WB、qPCR等技术观察凋亡基因Bax/Bcl2，AMPK-mTOR1-ULK1及Akt-Bcl2-Beclin1信号通路表达，比较不同时间窗电针干预抗IRI的效应差异，并从AMPK-mTOR1-ULK1及AKt-Bcl2-Beclin1信号通路，探讨电针抗IRI的自噬相关机制，为其抗IRI提供理论依据，也为临床抗IRI针刺介入治疗的时间窗提供依据。

背景：急性心肌梗死后的再灌注治疗会引起心肌缺血再灌注损伤（MIRI），如何减轻MIRI是目前亟需解决的问题。自噬在MIRI中具有重要作用，通过促进适度自噬、避免过度自噬调节自噬稳态来减轻MIRI是当前研究的重点。研究证实，不同时期的针灸介入，均存在一定程度的抗MIRI作用，然而其效应差异及具体机制尚未明确。.研究内容：本项目以MIRI大鼠模型为载体，通过Evansblue-TTC染色和ELISA技术检测血清心肌酶谱来评价心肌保护效应，在明确不同时间电针介入抗IRI效应特点的基础上，通过电镜观察自噬小体，免疫组化、蛋白免疫印迹和免疫荧光等技术探讨不同时间电针介入抗MIRI的自噬相关调节机制。.重要结果：电针内关穴预处理1-5d都能降低MIRI引起的心肌梗死面积，其中以4d和5d为佳；再灌注期电针内关穴干预可降低心肌梗死面积，实现对MIRI的心肌保护效应，其中以再灌注后30min进行电针干预最佳，同时，我们还观察到不同电流强度电针内关穴预处理4天均可有效抗MIRI，其中2mA电流强度保护效应相对最好。不论是电针内关穴预处理还是再灌注期电针内关穴干预，其抗MIRI的心肌保护效应均与抑制再灌注期过度自噬相关，其中电针内关穴预处理对MIRI的心肌保护效应可能是通过mTORC1-ULK1-FUNDC1这一信号通路调控线粒体自噬，进而增加线粒体来源的ATP，改善MIRI后的能量供应来实现的；再灌注期电针内关穴干预对MIRI的心肌保护效应可能是通过提高Bcl-2的表达以抑制凋亡，并对Bcl-2中Thr69，Ser70及Ser87位点磷酸化进行抑制以减少Bcl-2与Beclin1的分离进而抑制过度自噬，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。.科学意义：不同时间窗电针干预可产生一定的心肌保护效应，其中以电针内关穴预处理4d和再灌注后30min进行电针内关穴干预的心肌保护作用相对最佳，通过进一步研究我们发现该心肌保护效应与抑制再灌注期过度自噬有关，这为针刺抗心肌IRI的干预时机及其相关机制提供了一定的理论依据。